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          1. 基于免疫組織化學檢測的分子病理診斷

            發布日期:2017-07-05

            作者:方茹,王小桐,夏秋媛,周曉軍,饒秋(南京軍區南京總醫院病理科)

             

            免疫組織化學是目前病理診斷過程中不可或缺的工具,其在腫瘤的良惡性鑒別、分化分型、起源判定以及微生物檢測等方面發揮了重要作用。免疫組織化學本質是檢測基因在其終產物蛋白質水平的表達情況,在提供腫瘤基因信息尤其是分子病理改變方面起著重要作用[1]。與分子病理檢測相比,免疫組織化學檢測耗費低,用時短,消耗人力少,應用于常規病理診斷更加快速便捷。我們總結能夠反映分子病理改變,甚至替代分子病理診斷的相關免疫組織化學指標,并闡述其應用過程中存在的問題及注意事項。

             

            免疫組織化學可檢測到的腫瘤分子改變大致包括特異性染色體易位、基因突變、基因缺失、基因擴增和腫瘤相關性病毒感染。

             

            一、采用免疫組織化學檢測特異性染色體易位

             

            越來越多特異性的染色體易位在腫瘤中被發現,并且形成融合基因,但并不是所有的融合基因都能被免疫組織化學方法檢測到。以融合基因檢測診斷腫瘤需要以下一系列條件:

             

            1)融合基因在此腫瘤類型中高發;

             

            2)相關基因產物有適宜抗體的應用;

             

            3)目標基因由于易位而更換強啟動子導致該基因高表達;

             

            4)目標蛋白在正常組織中表達受限;(5)目標蛋白在其他腫瘤中不表達或者表達率低。

             

            1.TFE3TFEB易位的相關腫瘤:

             

            TFE3TFEB基因均屬于同一個轉錄因子家族,該家族成員還包括MITFTFEC。TFE3TFEB易位的相關腫瘤已經為人們所認識,包括Xp11腎細胞癌、腺泡狀軟組織肉瘤、色素性Xp11易位性腫瘤/伴有色素分化的Xp11易位性腫瘤/TFE3易位性PEComa以及t6;11)腎癌/TFEB易位腎癌[2,3,4]。染色體易位最終激活TFE3TFEB蛋白高表達。因此,我們可以利用免疫組織化學方法檢測TFE3TFEB蛋白來診斷相關腫瘤[5,6],其靈敏度和特異度分別達到97.5%99.6%。也可以檢測其下游的正向調控基因Cathepsink、HMB45Melan A來對其進行診斷,但后者對于TFE3易位相關性腫瘤并不總是有效。TFE3TFEB是一種轉錄因子,在正常組織中會有微弱表達,實際工作中不同的檢測條件下往往會出現假陽性。根據我們的經驗,當低倍鏡下可見明確的細胞核陽性且內對照為陰性時,能可靠提示腫瘤存在TFE3TFEB的基因易位(圖1)。此外,逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測融合基因需要知道準確的融合位點,且需要新鮮腫瘤組織,故不作推薦。熒光原位雜交(FISH)分離探針方法被認為靈敏度較高,但也有不足之處。當腫瘤為invX)(p11.2;q12/NONO-TFE3invX)(p11.2;p11.23/RBM10-TFE3時,FISH分離探針結果容易被誤判為陰性。invX)(p11.2;q12/ NONO-TFE3是位于X染色體短臂的TFE3基因和長臂的NONO基因發生了跨越著絲粒的轉位。其FISH分離信號一般介于12個信號之間,因此不易判讀(大于2個信號為陽性)。invX)(p11.2;p11.23/ RBM10-TFE3是位于X染色體短臂的TFE3基因和RBM10基因發生了在同一個短臂內的轉位。其FISH分離信號更不能辨別出TFE3基因易位。此時結合形態和免疫組織化學特點對診斷尤為重要。

             

            基于免疫組織化學檢測的分子病理診斷

             

            1TFE3易位性腎癌,腫瘤細胞核TFE3陽性表達 EnVision法 高倍放大;

             

            2孤立性纖維性腫瘤,腫瘤細胞核STAT6呈強陽性表達 EnVision法 中倍放大;

             

            3正常的生發中心bcl-2呈陰性表達 EnVision法 中倍放大;

             

            4濾泡性淋巴瘤中,bcl-2在濾泡中心部位的陽性染色反映了bcl-2易位的存在 EnVision法 低倍放大;

             

            5套細胞淋巴瘤中cyclin D1陽性表達 EnVision法 中倍放大;

             

            6纖維瘤病,腫瘤細胞核β-catenin陽性表達 EnVision法 高倍放大;

             

            7胰腺實性假乳頭狀腫瘤中,腫瘤細胞核β-catenin陽性表達 EnVision法 中倍放大;

             

            8卵巢高級別漿液性癌中p53廣泛的強陽性表達 EnVision法低倍放大;

             

            9高級別漿液性癌中p53染色完全缺失,同時內對照為陽性 EnVision法 高倍放大;

             

            10漸變型少突膠質瘤胞質IDH1強陽性 EnVision法 中倍放大;

             

            11彌漫型星形細胞瘤胞質IDH1強陽性 EnVision法 中倍放大;

             

            12乳腺小葉癌中腫瘤細胞胞質呈p120陽性表達 EnVision法 中倍放大;

             

            13高分化脂肪肉瘤胞核MDM2強陽性 EnVision法 中倍放大;

             

            14脂肪肉瘤胞核CDK4強陽性 EnVision法 中倍放大;

             

            15霍奇金淋巴瘤中Reed-Sternberg細胞持續穩定地表達EBV-LMP1 EnVision法 高倍放大;

             

            16宮頸癌中腫瘤細胞核p16呈彌漫強陽性表達 EnVision法 中倍放大。

             

            2.孤立性纖維性腫瘤:

             

            是一種少見的間葉源性腫瘤,其診斷需要與諸多梭形細胞腫瘤鑒別。STAT是一組可以與靶基因調控區DNA相結合的新型轉錄因子家族,具有信號轉導和轉錄激活因子雙重功能,STAT6是該家族的一員。SFT的病因至今未明,隨著分子生物學技術進展,新近有研究發現inv12q13q13NAB2-STAT6融合基因是SFT的一個重要驅動基因,SFT中存在高頻的NAB2-STAT6基因融合,推測該融合基因可能是導致SFT發生發展的重要分子事件?;驕y序、RT-PCR和免疫組織化學檢測發現NAB2-STAT6融合基因可導致STAT6強的核信號表達(圖2),免疫組織化學與基因測序結果具有高度一致性,陽性率高達98%,STAT6免疫組織化學染色能夠可靠地替代NAB2-STAT6融合基因的檢測。

             

            3.濾泡性淋巴瘤:

             

            它特征性存在t14;18)(q32;q21)易位和bcl-2基因重排,發生率高達70%90%。這種易位導致了bcl-2蛋白在瘤細胞中過度表達。雖然bcl-2在正常的淋巴細胞中廣泛表達,但是bcl-2并不表達于正常的生發中心(圖3)。因此,bcl-2在濾泡中心部位的陽性染色(陽性率83%91%)反映了bcl-2易位的存在,支持濾泡性淋巴瘤的診斷(圖4)。此外,有時易位的bcl-2基因會發生突變,從而造成濾泡性淋巴瘤bcl-2蛋白陰性染色。這種情況下可以更換其他克隆的bcl-2抗體(如E17)來幫助診斷[7]。檢測濾泡性淋巴瘤bcl-2基因易位的各種方法中,免疫組織化學的靈敏度與FISH的靈敏度相當,但比PCR的靈敏度要高。

             

            4.套細胞淋巴瘤:

             

            93%以上的套細胞淋巴瘤過度表達cyclin D1(由CCND1基因編碼),而正常的淋巴細胞不表達。因此套細胞淋巴瘤可以通過cyclin D1的免疫組織化學來診斷(尤其是用兔單克隆抗體;圖5)。在檢測t11;14)(q13;q32)的各種方法中,免疫組織化學靈敏度最高,陽性率50%60%。而RT-PCR檢測CCND1-IGH基因融合的陽性率25%50%,其靈敏度及特異度與FISH相當。cyclin D1很少在其他類型淋巴瘤中見到,偶爾見于慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、多發性骨髓瘤或漿細胞瘤,極少的彌漫性大B細胞淋巴瘤表達cyclin D1。

             

            5.間變性淋巴瘤激酶(ALK)易位的相關腫瘤:

             

            許多腫瘤以染色體2p13位點上的ALK基因易位為特點,其中包括間變性大細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、炎性纖維母細胞瘤、ALK陽性肺腺癌,發生于5%7%的病例[8]。極少數甲狀腺癌、乳腺癌和腎細胞癌也可發生。除了少數中樞神經細胞,ALK蛋白在正常細胞中并不表達。ALK基因重排導致ALK蛋白的表達激活,因此ALK的免疫組織化學陽性可以推斷存在ALK基因易位。此外,ALK的表達模式和ALK融合伴侶有關。EML4-ALK、TPM3-ALK、TPM4-ALK、CARS-ALK、ATIC-ALKSEC31L1-ALK融合類型的腫瘤中,ALK在胞質中表達。CLTL-ALK融合類型的ALK呈顆粒狀胞質陽性。RANBP2-ALK融合類型的ALK位于核周或核膜陽性[8]。ALK的免疫組織化學檢測比RT-PCR更加方便,其靈敏度和特異度與FISH相似。

             

            二、采用免疫組織化學檢測腫瘤的基因突變

             

            許多腫瘤具有特異的驅動基因突變,一些可以通過免疫組織化學來驗證,其結果可提供診斷線索。

             

            1.基因突變導致信號蛋白表達異常定位:

             

            β-cateninCTNNB1)基因在一部分腫瘤中發生突變,如結直腸腺癌、未分化甲狀腺癌、篩狀-桑葚狀亞型甲狀腺乳頭狀癌、胰腺實性假乳頭狀瘤、肝細胞腺瘤和韌帶樣纖維瘤(纖維瘤?。?。β-catenin的正常表達定位于細胞膜,然而β-catenin基因或者其Wnt信號通路基因(如APC基因)的突變可導致β-catenin蛋白在細胞核異常聚集[1]。β-catenin的細胞核免疫染色可以幫助診斷以下疾?。?/span>

             

            1)結直腸腺癌和卵巢、子宮以及膀胱腺癌的鑒別[9];

             

            2)纖維瘤病和其他梭形細胞病變鑒別[10](圖6);

             

            3)篩狀-桑葚狀亞型甲狀腺乳頭狀癌的確診[11];

             

            4)胰腺實性假乳頭狀腫瘤同胰腺其他內分泌腫瘤的鑒別[12](圖7);

             

            5)肝細胞腺瘤的診斷[13]。

             

            2.基因突變導致蛋白穩定性增強:

             

            p53基因突變在許多類型的腫瘤中均有發生,然而該突變也可以發生在一些腫瘤的早期階段,如女性生殖道的高級別漿液性癌以及潰瘍性結腸炎相關的發育異常。因此,p53檢測可以幫助疾病的診斷或分類。p53彌漫強陽性通常意味著p53基因突變,而其局灶弱陽性表達多與非突變事件引起的野生型p53聚集有關。漿液性癌和子宮內膜上皮內癌通常表現為廣泛的強陽性(圖8),然而部分正常組織、子宮內膜樣癌和透明細胞癌常表現出弱陽性或者片狀中等陽性[14]。文獻對于p53突變以及p53免疫組織化學陽性判讀的關聯性有爭議,目前認為如果以腫瘤細胞大于60%的廣泛陽性作為強陽性標準,p53突變與p53免疫組織化學陽性具有很高的一致性。如p53在腫瘤中染色完全缺失,但內對照為陽性染色(正常細胞弱到中等陽性)也可以暗示p53基因突變(圖9)。這主要是由于一些p53的截短突變不被p53的抗體所識別。因而漿液性癌中p53呈現一種“全有/全無”的表達形式。

             

            3.特異性突變抗體:

             

            一些特異性突變抗體可以結合在突變基因編碼的突變蛋白區域,因此,其免疫組織化學陽性染色反映了目標基因特異性突變的存在。這類抗體在未來將會越來越多,并應用于病理診斷。

             

            1)異檸檬酸脫氫酶1IDH1R132H:在Ⅱ或Ⅲ級神經膠質瘤中(包括星形膠質瘤和少突膠質瘤),IDH1基因的雜合突變是最常見的突變形式(約70%;圖10),而在其他原發性腦腫瘤中很少見[15]。在90%以上的IDH1突變病例中,核苷酸第395位點腺嘌呤代替了鳥嘌呤,從而在第132位點(R132H)上組氨酸代替了精氨酸。一種可以檢測IDH1-R132H蛋白突變的單克隆抗體(克隆號H09)可以用來證明膠質瘤中IDH1基因突變[16],主要的應用包括:

             

            ①預測膠質母細胞瘤患者的預后;

             

            ②區分膠質瘤(陽性)和膠質細胞增生(陰性);

             

            ③根據腫瘤邊緣以及治療后病變位點的活檢標本,判斷膠質瘤的累及情況[17](圖11)。此外,IDH1IDH2基因突變也好發于軟骨腫瘤,主要是IDH1 R132C的突變,而不是R132H[18]。該特異性突變抗體對鑒別軟骨肉瘤和軟骨母細胞型骨肉瘤很有幫助。

             

            2BRAF V600E位點的突變:BARF突變主要發生在甲狀腺乳頭狀癌、黑色素細胞痣、惡性黑色素瘤、低級別漿液性腺癌、卵巢交界性漿液性腫瘤、毛細胞白血病、朗格漢斯細胞組織細胞增生癥和后腎腺瘤中[19],特異性突變抗體可以檢測到BRAF中最常見的V600E位點突變,它僅可以檢測到攜帶突變的細胞,但是不能檢測到沒有突變的細胞。許多研究均顯示免疫組織化學染色與BRAF突變之間有著良好的一致性[20,21]。

             

            三、采用免疫組織化學檢測基因失活或者功能缺失

             

            抑癌等關鍵基因失活是腫瘤形成的關鍵機制,而關鍵基因功能的缺失可能是由于基因的失活突變、丟失或者啟動子甲基化,這些情況均可以通過免疫組織化學來檢測。

             

            1.微衛星不穩定性大腸癌的錯配修復蛋白:

             

            遺傳性非息肉性結直腸癌綜合征(HNPCC)包括早發性結直腸癌和其他一些癌癥如子宮內膜樣癌,其特點是患者具有錯配修復基因(如MLH1、MSH2、MSH6PMS)胚系突變。錯配修復基因缺陷導致了微衛星不穩定(MSI)的結直腸癌亞型。一小部分散發性結直腸癌也可表現MSI。存在MSI的結直腸癌比沒有MSI的結直腸癌預后要好。錯配修復蛋白免疫組織化學是否缺失是證實錯配修復基因功能狀態的一種快速方法。值得注意的是,在結直腸癌中錯配修復蛋白的缺失并不能鑒別HNPCC相關性腸癌和散發性MSI陽性的腸癌。HNPCC的確診需要分子病理檢測錯配修復基因是否存在胚系突變。在功能狀態下,錯配修復蛋白形成二聚體,MLH1(優勢方)與PMS2配對,而MSH2(優勢方)與MSH6配對。二聚體中優勢方(MLH1MSH2)的突變會導致二聚體中所有成分降解。然而,當非優勢蛋白(PMS2MSH6)發生突變時,這樣的情況就不會發生,因為非優勢蛋白的功能會被其他蛋白所取代。因此,MLH1MSH2的突變常會引起MLH1/PMS2MSH2/MSH6功能的同時缺失,然而PSM2MSH6突變常引起單獨的PMS2MSH6功能的缺失[22]。一些MLH1MSH6較為頻發的錯義突變,并不會影響蛋白質翻譯、穩定性和抗原性。在這些情況下,MSI可以幫助鑒別。因此在評估HNPCC的過程中,錯配修復蛋白免疫組織化學可以與分子MSI檢測綜合應用,以確定具體的功能缺失基因[5]。

             

            2.E-cadherin與乳腺小葉癌:

             

            乳腺小葉癌的主要特點就是E-cadherin缺失導致細胞間黏附性下降。E-cadherinCDH1)表達缺失可能有以下幾種機制:(1CHD1基因失活或者截短突變;(2CDH1啟動子甲基化;(3CDH1轉錄失活。因此,可以通過E-cadherin抗體的免疫組織化學染色缺失來診斷反映不同類型的分子改變,鑒別浸潤性小葉癌(陰性)和浸潤性導管原位癌(陽性)、小葉原位癌(陰性)和導管原位癌(陽性)、非特異性小葉增生(陽性)及多形性小葉癌[23]。約16%以上的小葉癌E-cadherin表現為陽性,這可能是由于伴有抗原決定簇完整的錯義突變所致。在這種情況下,還可以行p120-catenin免疫組織化學染色。腫瘤細胞表現為彌漫性胞質染色而不是膜染色時診斷為小葉癌[24]。正常情況下,p120-catenin結合在E-cadherin分子的亞質膜部分,因此免疫組織化學染色定位于細胞膜。E-cadherin功能失常,p120-catenin釋放到胞質中,導致異常的彌漫性胞質染色(圖12)。

             

            3.琥珀酸脫氫酶(SDH)相關腫瘤:

             

            SDH相關的遺傳性嗜鉻細胞瘤/副神經節瘤綜合征是一種常染色體顯性遺傳疾病,患者可能會發展為副神經節瘤、胃腸道間質瘤以及腎細胞癌。它以SDH基因的胚系突變為特點,SDH包含了4個亞基SDHA、SDHB、SDHCSDHD,任意1個亞基的突變都會導致SDH蛋白復合物的不穩定以及SDHB蛋白降解,表現為SDHB蛋白免疫表達缺失。SDHB的免疫組織化學可以反映任何SDH亞基的突變,為鑒別SDH突變的腫瘤提供了一個既敏感又特異的方法,而SDHA免疫組織化學表達缺失只反映SDHA亞基的突變。利用這2種抗體可以有效識別SDH缺陷相關性腫瘤。但在免疫組織化學判讀為陰性時,一定要以陽性內對照(血管內皮細胞、炎性細胞等)為參照,否則不能輕易判讀為缺失表達。

             

            四、采用免疫組織化學檢測基因擴增

             

            基因的擴增經常導致編碼蛋白的過表達。免疫組織化學對基因擴增的評估更具主觀性。因為染色強度可以被多種技術因素所影響,例如固定時間、抗原修復的強度以及免疫組織化學檢測系統的靈敏度等。

             

            1.乳腺癌中HER2的擴增:

             

            將近20%的乳腺癌表現出HER2基因的擴增。HER2的擴增與患者較差的預后相關,并且對內分泌治療有一定的抵抗性。然而,抗HER2的靶向治療(trastuzumab)可以針對HER2擴增的患者產生不錯的療效。由于免疫組織化學染色和分子改變之間有著較緊密的關系,為了篩選靶向治療的乳腺癌患者,HER2蛋白的免疫組織化學檢測是運用最廣泛的篩查或診斷工具[26]。整個檢測流程包括標本固定、取材、試劑的應用及最終檢測判讀,有嚴格的判讀和質控標準。為此相關專家形成共識并發表了中國乳腺癌HER2檢測指南[27],并就不斷遇到的新問題予以更新。

             

            2.高分化脂肪肉瘤、去分化脂肪肉瘤和低級別骨肉瘤中12q12-15的擴增:

             

            高分化脂肪肉瘤與脂肪瘤很難鑒別,尤其是在活檢標本中。去分化脂肪肉瘤與其他類型的肉瘤也常常難以鑒別。這2種形態的脂肪肉瘤的細胞遺傳學以染色體形成額外的環形結構以及染色體12q14-15區域形成多個拷貝為特點。許多不同的基因都定位在這個區域,如CDK4MDM2。在高分化/去分化脂肪肉瘤的診斷中,免疫組織化學染色高表達CDK4MDM2是一種有效的輔助診斷方法。CDK4的靈敏度和特異度分別是68%86%88%89%,而MDM2分別為86%100%59%74%[27]。高分化的中央型骨肉瘤和骨旁骨肉瘤都以12q14-15位點的擴增為特點[28]。在這些低級別骨肉瘤中,MDM2的陽性率在70%,而CDK4的陽性率為87%。這2個標志物中至少有1個陽性的幾率是100%,而2個都陽性的幾率是57%。其染色強度在大多數病例中是彌漫性、中等或者強陽性(圖13,圖14),而良性病變通常為陰性表達,因此,在與良性病變的鑒別診斷中,MDM2以及CDK4的免疫組織化學是一種有效的輔助手段[29]。

             

            五、采用免疫組織化學檢測腫瘤相關性病毒

             

            1.Epstein-Barr病毒(EBV):

             

            與多種腫瘤有關,包括淋巴瘤、淋巴上皮癌以及間葉腫瘤。腫瘤中EBV相關的基因及其蛋白隨著EBV潛伏類型的不同而變化[30]。EBV的檢測可以幫助腫瘤診斷及分型,最可靠的檢測方法就是原位雜交檢測EBV編碼RNAEBER),但是免疫組織化學更加簡便易行,在EBV檢測中也具有重要的價值。應用最廣泛的抗體是抗EBV-LMP1抗體。EBV潛伏模式各不相同,理論上講除了Burkitt淋巴瘤(Ⅰ型潛伏),EBV-LMP1免疫組織化學可以檢測到所有類型潛伏(Ⅱ型和Ⅲ型)EBV相關腫瘤中的病毒。但是事實并不是這樣,EBV-LMP1EBV相關腫瘤中的表達水平經常較低,以至于不能被常規免疫組織化學檢測[31]。因此,EBV-LMP1免疫組織化學出現陰性結果時也不能排除EBV感染。但對于EBV相關的經典霍奇金淋巴瘤,其R-S細胞持續穩定地表達EBV-LMP1(圖15)。因此,除了霍奇金淋巴瘤,EBV-LMP1的免疫組織化學并不能替代EBER原位雜交[32]。EBV核抗原2EBNA2)的免疫組織化學可以有效地檢測Ⅲ型潛伏相關腫瘤中的EBV。但是,其他一些EBV相關腫瘤(如移植后的淋巴組織異常增殖和老年人EBV陽性的大B細胞淋巴瘤)也可以表現出Ⅱ型或Ⅲ型的EBV潛伏類型。因此,EBNA2的陰性染色不能排除EBV的存在。

             

            2.人類乳頭狀病毒(HPV)相關腫瘤:

             

            HPV和人類皮膚、消化道、生殖道的多種良惡性病變相關,包括各種病毒疣、宮頸陰道的上皮內瘤變、宮頸鱗癌腺癌、食管鱗癌等[33]。檢測HPV可以幫助區分宮頸腺癌(HPV陽性)和子宮內膜腺癌(HPV陰性),此外HPV陽性的食管鱗癌預后好于HPV陰性的食管鱗癌。HPV免疫組織化學檢測的是HPV衣殼抗原,在這個階段病毒進入細胞核呈游離形式,并復制形成病毒顆粒(包括衣殼)。病毒的這種狀態通常存在于良性或低級別鱗狀上皮瘤變中,這種HPV抗體并不能反映HPV已經整合入宿主基因組。而這種整合入宿主基因組的感染通常出現在高級別上皮內瘤變和癌癥當中。HPV整合宿主基因組需要DNA原位雜交或檢測E6/E7 mRNA。p16是一種周期依賴性激酶抑制劑,受RB蛋白調控。正常情況下RB蛋白抑制p16轉錄,但在HPV感染情況下,其E6E7蛋白使RB蛋白失活,導致p16過表達。p16可以作為代理用來檢測高危HPV感染[34]。但這種應用僅限于確實存在高感染率的宮頸癌(圖16)和食管癌??谇?、喉、鼻咽癌及卵巢子宮漿液性癌HPV感染率低,雖然p16可以陽性,但并不能反映高危HPV感染[35]。其他潛在的調控機制也可以造成p16陽性[36]。p16尚可用于高級別鱗狀上皮內瘤變與低級別鱗狀上皮內瘤變的鑒別診斷,前者90%以上p16呈彌漫強陽性,后者陽性表達率低,呈散在局灶弱陽性表達。值得注意的是,子宮內膜異位和輸卵管子宮內膜化生病灶p16也可以陽性。此外,對于肺和食管同時出現的鱗狀細胞癌,p16有助于區別腫瘤是雙原發還是食管單發伴轉移。

             

            隨著免疫組織化學和腫瘤分子病理研究進展,免疫組織化學在為腫瘤提供基因信息方面扮演著日益重要的角色,在分子病理診斷中的應用已日趨成熟。隨著時間的推移,越來越多的免疫組織化學指標將被運用到分子病理診斷中,并指導更精準的腫瘤分型,從而為治療提供依據。

             

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